药敏质量控制.pptx

1、药敏试验的质量控制,复旦大学附属华山医院抗生素研究所叶信予deb_,药敏试验质量控制的目的,保证细菌的鉴定和药敏结果在临床诊断和治疗中的准确性和可靠性 满足疾病诊断和治疗的要求，实事求是地反映检验标本的客观存在与国际资料具有可比性,室间质控（external quality control）,是由外部机构控制实验室质量的客观过程。内容：病原菌鉴定、药物敏感试验 目的：比较差异、改进措施、确定培训需求、客观 证据、支持实验室认可、增加实验室信心、监督工具国内外权威机构：国内：卫生部临床检验中心、上海临床检验中心 等国际：WHO/CDC 抗菌药物敏感性试验质控 英国 环球微生物学质控 美国 CAP

2、质控,室内质控（internal quality control),保证检验质量的高水平实验室工作人员的素质微生物检验的标准操作（细菌鉴定、药敏试验）标本取材、登记、采集检测仪器的性能培养基、试剂质量、保质期标准菌株,药物敏感性试验,测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用的方法世界卫生组织推荐：常规的药敏方法为纸片琼脂扩散法（K-B纸片琼脂扩散法）科研方面主要为稀释法，包括液体稀释法（试管法、微量法）和琼脂稀释法分子生物学方法、酶试验,K-B纸片琼脂扩散法,是一种定性试验：S、I、R操作简便，常规工作中最常应用影响因素多存在一定局限性,稀释法,肉汤稀释法常量（大量）肉汤稀释法（试管法）微量

3、肉汤稀释法琼脂稀释法 是一种定量方法，结果精确操作繁琐，要求严格,E-test法,定量方法操作简便，容易观察价格昂贵,分子生物学法,测遗传耐药机制如PCR检测葡萄球菌mecA基因等其他还有核酸杂交等方法,酶试验,测生化耐药机制。如碘量法、酸量法、Nitrocefin法等测-内酰胺酶。ESBLs、AmpC酶检测等。-内酰胺酶试验阳性：可快速预报嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉氏菌对青霉素、氨苄青和羟氨苄青霉素耐药。葡萄球菌对青霉素及氨基、羧基和酰脲基青霉素类药物的耐药性。,纸片琼脂扩散法,如果仅仅基于抑菌环的有无，而不考虑抑菌环的大小，则无法检测抗菌药物的敏感性。只有将检测方法和抑菌环直径测量标准

4、化的方法相结合进行试验，才能获得可信的结果。必须采用CLSI推荐的标准操作方法进行试验，才能获得可重复的结果。,纸片琼脂扩散法的影响因素,技术人员的操作培养基药敏纸片接种物制备试验操作孵育条件、温度和时间药敏结果读取质控菌株,技术人员,应经过训练能进行检验能熟练使用仪器有评价检验结果有效性的能力细心、用心、责任心,培养基,水解酪蛋白琼脂（M-H琼脂）：最适用于常规药敏测试非苛养菌的培养基。原因：药敏试验显示了可接受的批间重复性。其含有影响磺胺、甲氧苄啶和四环素敏感性试验结果的抑制剂浓度低。能使绝大多数非苛养菌生长良好。已积累了用此培养基进行的敏感性测试的大量数据和经验。,培养基,苛养菌：需加入

5、营养添加剂5%脱纤维羊血MH琼脂含SR158生长因子的HTM培养基GC琼脂基质+1%规定的生长添加剂,培养基,pH值：室温条件下7.2-7.4之间。因此必须在凝固之后检测检测方法：浸渍足够多的琼脂完全掩盖pH机电极的尖端少量的琼脂在烧杯中凝固在pH机电极的尖端的周围使用表面电极,培养基,pH值小于7.2，变化会显著改变一些药物的抑菌环大小氨基糖苷类、克林霉素、大环内酯类及喹诺酮类抑菌环变小青霉素、四环素抑菌环变大pH值大于7.4，会出现相反的结果,培养基,胸苷或胸腺嘧啶：过量可以逆转磺胺类和甲氧苄啶的抑制作用，从而产生更小、更不清楚的抑菌环，甚至没有抑菌环的出现，可能导致错误的耐药报告粪肠球菌

6、ATCC 29212，用复方新诺明纸片测试，满意结果为清晰、鲜明的抑菌环，直径20mm,培养基,二价阳离子：钙和镁离子：影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的药敏结果。含量过高，抑菌环变小含量过低，抑菌环变大钙离子含量的变化也会影响达托霉素的药敏结果含量过低，抑菌环变小含量过高，抑菌环变大过量的锌离子可使碳青霉烯类抑菌环变小,培养基,平板厚度一定要标准，达到4mm厚度9cm平板倾注琼脂量25-30ml；15cm平板需60ml左右同一平板内的琼脂要均一厚度湿度：使用时，琼脂的表面应是潮湿的，但不能有液滴出现在培养基的表面或平板盖子上有效期：7天储存温度：2-8,药敏纸片,可靠的供应商：OXOID

7、、BD纸片应当同时至少有一个分析说明的纸片批号和浓度的证书，并能提供用推荐的质控细菌进行质控的数据药物含量必须符合CLSI规定的浓度,药敏纸片,纸片的储存：药敏纸片的外包装可以确保适当的无水条件纸片应冷冻在-20或以下的冰箱内，密封保存。除了因工作需要而少量冷藏外（最多冷藏一个星期），尤其是含-内酰胺类药物、不稳定药物（如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸复合剂）一旦药敏纸片从密封的包装中取出，必须放置在一个完全密封干燥的容器中储存,药敏纸片,药敏纸片的使用使用前从冰箱内取出并除去密封包装，平衡至室温。这样可以最大限度地减少热空气接触冷的纸片时产生冷凝水只使用没有超过制造商表明的有效期的纸片，丢弃过

8、期的纸片,药敏纸片,接种物制备,浊度标准：0.5麦氏浓度标准，相当(1-2)108个菌落形成单位(CFU)/ml。接种物浓度过高，会导致某些-内酰胺类药物耐药校准方法肉眼观察比浊：应在足够的光线下贴靠着有白色背景和对比黑线的比色卡比较接种管和0.5麦氏浓度标准管BaSO4浊度标准管：625nm处的吸光度值为0.08-0.10，每次使用需要充分震荡，每个月更换商品化的乳胶悬浮液：每次使用之前上下颠倒混匀，有效期内使用光学浊度仪,接种物制备,细菌生长曲线迟缓期：菌体增大，代谢活跃，为细菌的分裂增值合成、储备足够的酶、能量及中间代谢产物，1-4h对数期：此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环

9、境因素的作用敏感，抗菌素作用对该时期的细菌效果最佳,8-18h稳定期：此期细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物衰亡期：生理代谢活动趋于停滞,接种物制备,制备方法直接菌落悬浮法：最方便的方法。可用于大多数细菌。从16-18h培养的琼脂平板（应选用非选择性培养基，如血平板）上挑取数个单个菌落直接接种到肉汤或生理盐水制成菌悬液，调整菌悬液至0.5麦氏。,接种物制备,制备方法生长法：无法用上述方法制备菌悬液的情况下选用。从琼脂平板上选择3-5个形态相同的单个菌落，用接种环或无菌拭子将菌落转移至含有4-5ml合适的肉汤培养基的试管中，如胰蛋白酶大豆肉汤。在35孵育培养，直到达到或超过

10、0.5麦氏浓度（通常2-6h）浊度。用无菌生理盐水或肉汤调整新鲜生长的肉汤悬液的浊度到0.5麦氏浓度。,试验操作,接种平板：调整好浊度的菌悬液最好在15min内将无菌棉签浸取，同时在管壁上出去棉签上多余的液体用拭子划线整个琼脂表面，接种于表面干燥的MHA平板上，每次旋转平板约60，以确保每次接种均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈盖子可半开3-5min，但不可超过15min，以便放置药敏纸片前，使琼脂吸收表面多余的水分,试验操作,放置纸片：将预先设定好并已经平衡至温度的药敏纸片分置在已接种细菌的琼脂表面每个纸片必须压下以确保与琼脂表面完全接触。无论是单独放置或使用纸片分配设备，纸片必须分布均

11、匀，两纸片圆心的距离不少于24mm最好在预期的产生小的抑菌环的纸片旁边放置产生大的抑菌环的纸片，以避免重叠区纸片距离琼脂边缘的距离同样重要，如果太靠近边缘，抑菌环可能不完整，建议距离平板边缘15mm。药敏纸片一旦与琼脂表面接触，就不可再移动放置纸片后15min内倒置平板进行培养,试验操作,孵育温度：（35 2）孵育条件：除嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌和链球菌外，孵育不需要CO2CO2浓度变化会显著改变一些药物的抑菌环大小孵育时间：16-18h测试 苯唑西林或万古霉素对葡萄球菌属，或万古霉素对肠球菌属的敏感性，孵育时间必须达到24h,平板结果判读,培养后的平板观察细菌的涂布是否满意接种是否

12、正确产生的抑菌环是否均匀为圆形菌苔是否融合生长如果可见单个菌落，说明接种量过稀，必须重复试验,平板结果判读,测量方法：用肉眼判读，测量完全抑制区的直径，包括纸片的直径采用游标卡或尺子在培养基的背面测量将培养基放在一个黑色不反光的背景上，并用反射光观察如使用血平板，应除去盖子并用反射光照射，在琼脂的上方测量抑菌环,抑菌圈直径阅读游标卡尺,抑菌圈直径阅读直尺,平板结果判读,测量直径没有肉眼可见的明显的生长区即可认为抑菌圈边缘。只能在放大镜下观察到的细小菌落忽略不计。在一个明显抑菌环内有分散的菌落生长时，应该从原始菌落移种后重新测试。如分散的菌落依然在抑菌环内生长，则应测量无菌落的抑菌环内径。变形杆

13、菌属细菌可迁徙生长到某种抗菌药物抑菌环内，忽略明显的抑菌环内薄纱样迁徙生长。测量血平板上的抑菌环时，测量的是生长抑菌圈，而不是溶血抑制圈。测量含甲氧苄啶和磺胺类药物的抑菌圈时，忽略少量生长，测量比较明显的边缘，以确定抑菌环的直径。,结果解释,根据CLSI推荐的判断标准，报告细菌对抗菌药物的敏感性有判断标准：敏感、中介、耐药只有敏感的折点：敏感同属细菌不同种判断标准可能不同,不可能出现的药敏现象,金葡菌：青霉素 S,苯唑西林 R，万古霉素 R肠杆菌科细菌：第三代头孢菌素 R，第一、第二代头孢菌素 S嗜麦芽窄食单胞菌：出现碳青霉烯类 S,药敏质控,目的药敏试验过程的精密度（可重复性）和准确度在试验

14、中所作用的试剂的性能。进行实验和结果判定操作者的工作情况。责任制造商：确保制造出合适的产品实验室：确保试验很好地维护和执行 方法标准菌株,质控标准菌株,使用精心挑选的质控标准菌株实验在可接受的标准内操作进行检测结果可靠每个质控菌应从认可的来源处获得（美国标准菌库，ATCC）适用于抗菌药物和标准方法（CLSI推荐）,质控标准菌株,分类：日常检测质控菌株：确保检测系统正常运行，并且检测结果在制定的范围内大肠埃希菌 ATCC 25922金黄色葡萄球菌 ATCC 25923等补充的质控菌株：用于评价某一特定情况下实验或者检测系统的特性，或称为备用质控菌株嗜血杆菌 ATCC 10211肺炎克雷伯菌 AT

15、CC BAA-1705等,质控标准菌株,检测和储存使用和检测临床分离株相同的材料和方法，按照标准纸片琼脂扩散法，来检测质控菌株合理储存和维护，确保质控菌具有可接受的性能储存菌株：长期贮存，可用Microbank,40%甘油肉汤、脱纤维羊血或脱脂牛奶，于-70 低温度保存。半储存菌株：使用中的质控菌应贮存在胰大豆琼脂（非苛养菌）或营养丰富的巧克力琼脂斜面（苛养菌），4-8 保存，每周传代一次。应用菌株：每次使用前应把半储存菌株传代到相应的平皿上使其获得单个菌落。,质控标准菌株,防止质控菌株的变异保存菌株应加保护液（脱脂奶粉或甘油）尽量减少转种次数，一般不要超过6次孵育时间不要超过对数期避免菌种被

16、污染不要从药敏试验的琼脂平板上取细菌使用 如果出现无法解释的结果表明细菌的天然敏感性已经改变，需要制备新的原代培养物,常用质控菌株,Q：沙门菌属细菌在进行纸片法药敏试验时应该选择哪种ATCC标准菌株？,A：1.铜绿假单胞菌 ATCC 278532.金黄色葡萄球菌 ATCC 259233.肺炎克雷伯菌 ATCC 7006034.大肠埃希菌 ATCC 352185.大肠埃希菌 ATCC 25922,（）,Q：为什么大肠埃希菌ATCC 35218会出现氨苄西林耐药，氨苄西林/舒巴坦敏感？,A：因为大肠埃希菌ATCC 35218会产生-内酰胺酶，所以氨苄西林对其没有抗菌作用而表现为耐药，但舒巴坦为-内酰胺酶的酶抑制剂，可抑制大肠埃希菌ATCC 35218产生的-内酰胺酶，因此又恢复抗菌活性，因此氨苄西林/舒巴坦表现为敏感。,质控菌株的传代及使用,新储存物或冻存物,用合适的培养基与适宜的孵育条件进行传代培养（首次传代）,正确传代培养、孵育和保存质控菌株。用分离的单个菌落作为第1天道第7天的试验用质控菌。,每天准备新的传代培养物（从第1天试验用培养物分离）。相应的菌株类型保存在适宜的温度下。每天测